各位朋友大家好，今天翻译的是2017年《NATURE COMMUNICATIONS》期刊上的文章：Structural and functional analysis of the human POT1-TPP1 telomeric complex。
POT1和TPP1是Shelterin复合体的一部分，对端粒长度的调节和维持是必不可少的。端粒POT1-TPP1复合体的自然突变与家族性胶质瘤、黑色素瘤和慢性淋巴细胞白血病有关。在这里，我们报告了人类端粒POT1-TPP1复合体相互作用部分的原子结构，并建议这些突变中的几个如何导致恶性肿瘤。POT1 C-末端(POT1C)形成由OB-折叠和假日连接解析酶结构域组成的双叶结构。TPP1由几个环和螺旋组成，参与与POT1C的广泛相互作用。生化数据显示，几个与癌症相关的突变部分破坏了POT1-TPP1复合体，从而影响了其有效结合端粒DNA的能力。有缺陷的POT1-TPP1复合体会导致更长和更脆弱的端粒，这反过来会促进基因组的不稳定和癌症。
Shelterin是一种六聚体核蛋白复合体，负责维持染色体末端的完整性，称为端粒。人类Shelterin 由TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、POT1和TPP1组成，结合双链和单链端粒DNA，参与广泛的功能。它通过加帽和保护染色体末端不被识别为DNA双链断裂来抑制DNA损伤反应。它通过隔离端粒突出部分来防止外切核酸酶的降解。它还通过调节端粒酶对端粒突起的访问来控制端粒的长度。
POT1在端粒上具有广泛的功能，所有这些功能都是为了维持端粒悬垂的完整性。POT1以高亲和力和特异性结合单链端粒DNA。POT1-DNA结合隔离端粒悬垂，从而帮助端粒加帽，下调端粒伸长和依赖ATR的DNA损伤反应。POT1端粒DNA结合由蛋白质的两个N-末端OB-折叠介导，而蛋白质的C-末端部分与TPP1结合。人和S.pombe TPP1与POT1的结合将其DNA结合性能提高了10倍。在细胞周期的S期，人POT1-TPP1复合体通过端粒酶与位于TPP1的N-末端OB-折叠的TEL贴片直接接触，将端粒酶招募到端粒。POT1与端粒突出部分的结合可以分解G-四链体，并允许端粒酶装载到端粒上以延长端粒。
最近发现POT1在慢性淋巴细胞白血病、家族性黑色素瘤和神经胶质瘤中频繁突变。据报道，目前有137个自然发生的POT1突变与人类疾病有关(癌症基因组学生物门户网站)。其中许多突变定位于N端的OB-折叠，破坏POT1-DNA的结合，而其他突变位于蛋白质的C-末端，为TPP1结合。POT1 N端突变主要破坏DNA结合，并与染色体异常有关，如端粒长度不规则、易碎端粒和染色体端到端融合，这些表型通常与端粒脱帽有关。然而，人类POT1 C末端(POT1C)突变在人类疾病中的确切作用目前尚不清楚。
在这里，我们研究了POT1-TPP1组装的机制以及自然发生的POT1突变是如何导致癌症的。我们的数据表明，POT1 C由两个结构域组成，一个是OB-折叠，一个是假日连接解离酶(HJR)结构域，这两个结构域都与TPP1发生广泛的相互作用，形成紧密的异源二聚体。对结构的检查表明，这些突变中的几个要么扰乱POT1C折叠和/或破坏POT1-TPP1结合。改变POT1-TPP1复合体的自然状态会影响端粒悬垂的完整性，导致染色体异常，与端粒覆盖复合体功能障碍有关，从而导致基因组不稳定和癌症。
我们通过有限的蛋白质降解和全长POT1-TPP1复合体的质谱分析产生了人POT1和TPP1的相互作用结构域(图1a,b)。POT1C由残基330-634和TPP1 255-337(TPP1(PBD))组成(图1a,b)。我们用单波长反常色散(SAD)方法和汞导数(表1)求解了结构。
该图显示了POT1C残基332-633和TPP1(PBD)残基266-326的清晰电子密度(图1C)。
POT1C由一个经典的OB-折叠和一个假日连接解析酶结构域(HJR)组成(图1D)。POT1C(OB)是一种典型的OB-折叠，在结构上最类似于Oxytricha Nova端粒末端结合蛋白(TEBPa, PDB ID: 1OTC—RMSD=2.2 Å-图1E)。值得注意的是，TEBPα和β二聚体(PDB ID：1OTC)的覆盖。与POT1-TPP1结构的结构没有显示出两个杂二聚体的组织相似之处。OB-折叠的六条β链的组织在蛋白质表面形成了一个深而明确的凹痕，组成了OB-折叠的典型结合口袋(图1D)。有趣的是，HJR是OB折叠的插入，由残基P392-L538组成。HJR在结构上类似于Archaeoglobus fulgidus solvase结构域(AfHJR，PDB：ID 2WIW)，具有RMSD 2.7ä(图1F)。HJR由7个反平行的β链组成，周围有5个α螺旋(A3、4、5、6、7)(图1D，f)。POT1C(HJR)与AfHJR结构域的结构比较突出了这两个HJR结构域之间的两个明显差异。一个不同之处在于两个HJR结构域中存在的螺旋的组织，五个螺旋中有四个不重叠(图1F)。这两个HJR结构域之间的另一个显著区别在于HJR的DNA结合口袋。在AfHJR中，双链DNA结合主要由位于蛋白质表面的两条短的反平行的b链介导，远离构成结构域核心的五条b链。在HJR中，这两条链已经移动了50度旋转和18°平移，是由该结构域的所有七条b链产生的测试表的组成部分(图1F)。
(C)1西格玛等高线水平的模拟退火法遗漏图的一部分(与POT1的OB折叠结合的TPP1)的立体图像。
(D)人POT1C-TPP1(PBD)络合物的X射线晶体结构；POT1C的OB折叠和HJR分别以蓝色和红色显示；TPP1(PBD)以绿色显示。四种半胱氨酸(C382、C385、C503和C506-Stick)配位的锌离子呈青色球状。
(E)POT1C和Oxytricha nova端粒末端结合蛋白α亚单位的重叠(OnTEBPA-米色，PDB ID：1OTC)OB折叠。(F)POT1C HJR(红色)与其最接近的结构同系物Archaeoglobus fulgidus HJR(AfHJR-青色；PDB ID：2WIW)的覆盖。
HJR的DNA结合口袋被螺旋A3占据，A3是HJR的N端螺旋。两个POT1C结构域之间的广泛相互作用产生了一个长的、几乎是圆柱形的结构，为TPP1结合提供了广泛的表面积。双叶POT1C结构的进一步稳定是由位于两个结构域(图1D)界面的锌离子配位的四半胱氨酸簇(C382、C385、C503、C506)介导的。
TPP1(PBD)是一个延伸的螺旋，有四个α螺旋分布在整个蛋白质中。TPP1多肽跨越POT1C的整个长度，并与其两个结构域进行广泛的接触(图1D)。有趣的是，TPP1(PBD)与POT1C的取向相反(N-to-C-末端)，使得TPP1(PBD)(A1)的N-末端部分与HJR相互作用，而C-末端与OB-折叠相互作用。特别是，TPP1(PBD)的A1与HJR的b-链产生的b-折叠表面发生了广泛的相互作用。它还与POT1C的螺旋a5相互作用，后者位于HJR的b-折叠的同一面，与形成b-折叠的b-链平行(图1d)。TPP1(PBD)螺旋A1是富含亮氨酸/缬氨酸的，与POT1C、HJR的大多数接触在性质上是疏水的(图2A)。TPP1、Leu271被埋在POT1C的L445、F438和F470形成的大疏水口袋中。TPP1、L274的侧链堆叠在POT1C、F470的侧链上。TPP1、V272和A275由POT1C、F438和W424的侧链协调。POT1C的W424也与E278形成了有效的氢键。L279被埋在POT1C表面由残基W424、V436、L466、V434和E462侧链的脂肪部分形成的明确的疏水口袋中。L281也埋在POT1的这个口袋里，但触点仅限于W424和T426的侧链。
连接TPP1(PBD)螺旋a1和a2与POT1C的环之间的接触仅限于残基C285和P288。这两个残基都与POT1C的OB-折叠发生轻微的疏水作用。环路还通过该环路的主干和POT1C的E394之间的2.7Å氢键保持在适当的位置。
TPP1(PBD)螺旋a2定位于POT1C、OB-折叠和HJR结构域的界面，在那里它参与与蛋白质的广泛和特定的相互作用(图2B)。值得注意的是由TPP1的高度保守的W293和R297产生的接触。大的W293侧链被埋在一个由POT1残基F542、V583、V573、L574、F542、V378和Q580的脂肪部分组成的深疏水口袋中，这些部分组成了OB-折叠的部分螺旋a2、a7和a8。POT1、Q580的侧链也与TPP1 a2主干和H292的侧链氢键结合。TPP1的R257也定位在POT1C的OB和HJR界面，但与W293不同的是，它的侧链通过溶剂分子参与与POT1C的相互作用网络(图2D)。R257和POT1C之间唯一的直接接触涉及与V391主干的氢键。
TPP1与POT1C OB-折叠之间的其他接触是广泛的，涉及螺旋A3和A4以及连接它们的线圈(图2C)。这两个螺旋都被对接到OB-折叠的规范的、绑定的口袋中。更具体地说，TPP1 Y306侧链与POT1C的P371堆叠。TPP1、V308和L313的支化侧链被埋在位于OB-折叠结合口袋底部的油腻疏水斑块中。连接A3和A4的接头的TPP1、I315与POT1 Y610、F625和K608侧链的脂肪部分配位。TPP1的C-末端螺旋(A4)与POT1C之间的接触仅限于L325以及POT1C的P357和K608的侧链。
(D)R477T、A532P和I532F疾病突变构成POT1C的HJR的一部分。这些氨基酸相对于最近的TPP1结构元件(A1-绿色)的位置如图所示。
(E)显示了TPP1(PBD)(绿色)的POT1C OB-折叠(蓝色)与螺旋A3和A4之间的广泛相互作用。疾病突变C591W和Q623H用方框突出显示。
有几个POT1C突变(L343F、P446Q、P475L、R477T、A532P、I535F、C591W和Q623H)与家族性胶质瘤、黑色素瘤或CLL相关(补充表1)。这些突变中的大多数(L343F、P446Q、P475L、R477T和C591W)是体细胞突变，是CLL所特有的)，而A532P和Q623H是遗传性胶质瘤和黑色素瘤的特有种系。为了确定POT1C疾病突变在POT1-TPP1结合和复合体组装中的作用，我们进行了等温滴定热法(ITC)测量。实验使用纯化的野生型(WT)TPP1(PBD)(残基255-337)和WT或突变体POT1C(残基330-634)(补充图1)，与我们用于POT1C-TPP1(PBD)复合物结晶的结构相同。这些蛋白在大肠杆菌中过表达，并通过三个连续的纯化步骤纯化到均一，如手稿的方法部分所述。除了I535F外，所有的TPP1(PBD)和POT1C、WT和突变蛋白都稳定过表达，并有足够的数量用于拟议的研究(补充图1)。
考虑到两种蛋白质之间广泛的相互作用网络，TPP1与POT1的结合常数在纳摩尔范围内也就不足为奇了(Kd=120±16 nm-图3 b,f)。在测试的七个突变POT1C蛋白中，只有P446Q、C591W和Q623H显示出显著的TPP1结合丢失(KDS分别为289、870和471 nM-图3c,g,h,i；补充表2）。P475L的TPP1结合量略有下降(164±32 nM)，但差异无统计学意义(P=0.22)。相反，L343F、R477T和A532P显示出几乎WT TPP1结合亲和力(KDS 114、123和117 nM-图3 b、e、f、I和补充表2)。与这里给出的POT1C-TPP1(PBD)结构一致，P446和Q623与TPP1直接接触，而C591W突变很可能使POT1C(OB)的A8移位(图2e)，从而间接影响TPP1的结合。P475位于HJR的内部，对该结构域的折叠起作用。L343、A532和R477位于远离POT1的TPP1结合部位，要么参与蛋白质的折叠(L343、A532)，要么暴露在溶剂中(R477)，它们的功能目前尚不清楚。
图3|POT1 C和TPP1 (PBD)蛋白的ITC结合数据。(a-h)WT和突变体(L343F、P446Q、P475L、R477T、A532P、C591W和Q623H)POT1C与TPP1(PBD)的ITC结合数据。(I)根据拟合的ITC数据得出的WT和突变POT1C蛋白的结合常数(Kd，mm)条形图。对WT进行了三个独立的ITC实验和双尾学生t检验：*Po0.05，**Po0.01。数据清楚地表明，POT1C、P446Q、C591W和Q623H突变减少了TPP1的结合。
由于POT1-TPP1复合体与端粒酶活性直接相关，我们询问与人类疾病相关的POT1C突变是否影响端粒酶活性。值得注意的是，与端粒酶结合有关的TPP1的TEL斑点位于TPP1的N端。为了解决这个问题，我们使用高表达超级端粒酶的细胞提取物和饱和水平的全长、WT或突变的POT1-TPP1进行了直接端粒酶活性分析。按照Lingner等人的描述，制备了高表达人超端粒酶的HEK293T细胞提取物(超级端粒酶质粒是Lingner实验室的礼物)。我们还过表达并共纯化了全长POT1和由87-544残基组成的TPP1的N端截短((TPP1(87))(图1A)。这两种蛋白在大肠杆菌中分别过表达，细胞在纯化前共裂解，以形成稳定的POT1-TPP1复合体。我们发现，这两种蛋白质的单独纯化导致了TPP1的部分降解，这表明TPP1单独并不稳定(图4A)。我们无法纯化足够数量的全长I535F POT1突变体来进行这次实验。此外，我们制备了高表达人超端粒酶、全长POT1和TPP1的HEK293T裂解物，如Nandakumar等人所描述的。我们用免疫印迹分析检测了WT和突变型POT1和TPP1蛋白在HEK293T细胞中过表达的稳定性和水平。Western印迹分析表明，所有蛋白质(WT和突变体POT1和TPP1)的表达水平与WT蛋白相似(图4B)。
这两种方法都显示出强大的端粒酶活性，在WT POT1-TPP1复合体(图4C-f和补充图2)存在的情况下端粒酶活性增加，这与先前报道的一致。POT1突变体L343F、P475L、R477T、A532P和I535F显示出WT端粒酶活性(图4C-f)，这与ITC的数据一致，表明这些突变蛋白与TPP1结合具有WT结合亲和力(图3、a、b、d-f和i)。出人意料的是，P446Q、C591W和Q623H POT1突变体与TPP1的亲和力降低了2-7倍(图3C，g，h和i)，也在误差范围内显示了WT端粒酶的活性(图4 C-f)。
图4 端粒酶直接活性分析。(A)超端粒酶提取物(STE)和大肠杆菌纯化的全长POT1(FlPOT1)和TPP1(87)蛋白的SDS-PAGE凝胶，用于直接测定(C)。红色箭头表示TERT预计运行的位置(B130 KDa)。在150 nm纯化的POT1-TPP1复合体存在下，进行c中的测定。
(B)直接测定板(D)的HEK293T裂解产物的Western印迹。凝胶显示瞬时表达的POT1和TPP1的水平远远高于TERT的水平，证实了直接检测是在POT1和TPP1的饱和水平进行的。
(C)用2毫克STE、150nm纯化的WT或突变体(L343F、P466Q、P475L、R477T、A532P、I535F、C591W和Q623H) flPOT1、150nm的WT TPP1(87)和20 NM的引物A5(TTAGGTTAGCGTTAGGG)进行端粒酶直接活性测定。
(D)用5毫克STE与WT或突变体(L343F、P466Q、P475L、R477T、A532P、C591W和Q623H)flPOT1和WT全长TPP1(FlTPP1)共转染进行端粒酶直接活性检测。在STE中添加20 NM的A5引物。在凝胶(c和d，e和f)的右侧分别显示了添加到该引物中的端粒重复数，以定量面板(C)和(D)的端粒酶活性。这些值是四个独立实验的平均值；误差条表示S.D.
POT1以高亲和力和选择性与端粒悬垂结合，这一过程被TPP1结合所增强。为此，我们询问位于蛋白质C-末端的POT1疾病突变体是否影响POT1-DNA结合。在(A)用于晶体和ITC研究的POT1C和TPP1(PBD)蛋白质复合体(图1b和3a)(B)全长POT1WT和三个突变体(P446Q、C591W和Q623H)蛋白质和(C)纯化的大肠杆菌、全长WT和突变体(L343F、P446Q、P475L、R477T、A532P、C591W和Q623H)POT1和用于端粒酶直接分析的N端截短的TPP1 (87)的存在下，用由三个端粒重复序列(TTAGGG)3 (18mer)组成的荧光标记DNA探针进行了荧光偏振(FP)分析。
FP数据表明，POT1C单独和POT1C-TPP1(PBD)复合体不能与单链端粒DNA结合(图5A)。全长WT和突变(P446Q，C591W和Q623H)POT1蛋白单独与单链端粒DNA结合，Kd为B20 nm(图5B，d；补充表3)。对于POT1-TPP1复合体，我们的数据表明WT复合体与端粒悬垂结合的距离约为5.8±0.5 nM(图5C，d和补充表3)，与先前报道的一致。有趣的是，P446Q，P475L，C591W和Q623H突变体显示DNA结合亲和力降低(Kd≈10.3±1.0 nM，10.7±1.4 nM，15.6±2.5和8.9±1.0 nM--图5C，d和补充表3)，与ITC的数据一致，这表明这些POT1突变蛋白部分破坏了POT1-TPP1复合体(图3和补充表2)。此外，具有野生型TPP1结合亲和力的L343F、R477T和A532P POT1突变体(图3和补充表2)也与具有野生型亲和力的端粒DNA结合(图5C，d和补充表3)。
(D)条形图显示WT与突变体flPOT1和flPOT1-TPP1(87)复合体之间Kd(NM)的差异。这些值是三个独立测量的平均值，并对WT POT1-TPP1(PBD)复合体执行双尾学生t检验：*P<0.05, **P<0.01。
为了确定POT1C突变对端粒靶向的影响，我们在HEK293T细胞中共表达了YFP标记的POT1和mCherry标记的TRF2，并使用共聚焦成像来检查它们的定位。将Cherry-TRF2和YFP-POT1瞬时导入HEK293T细胞，24 h后固定。对转染的HEK293T细胞的全细胞裂解产物进行的Western印迹分析显示，WT和突变的YFP-POT1蛋白过表达(图6A)。所有POT1突变体都与CherryTRF2共定位，类似于野生型，这表明突变并不阻止POT1端粒靶向(图6B)。
(B)显示了YFP-POT1(绿色)和Cherry-TRF2(红色)蛋白共定位的最大投影图像。合并的图像包括DAPI。比例尺，5毫米。数据清楚地显示了WT和突变的flPOT1蛋白在端粒上的共存。
为了确定POT1癌突变是否维持端粒长度稳态，我们对WT和突变型POT1转染的HEK293T细胞进行了Southern杂交分析。通过慢病毒感染获得稳定表达Flag-POT1的HEK293T细胞系。我们通过针对其3'UTR区域的shRNA (ShPOT1)降低了内源性POT1的水平(图7A)。我们还通过与载体(不携带POT1基因)和带有或不带有shPOT1的HEK293T细胞共感染，产生了两个模拟处理的对照细胞系。
图7|WT和突变体POT1的Southern杂交分析。(A)定量RT-PCR显示慢病毒感染HEK293T细胞后，内源性POT1的mRNA表达下调，归一化为GAPDH转录本水平；用扑霉素和布拉西丁进行筛选；(N=3)。
(B)Western印迹显示WT和突变体POT1蛋白在表达shPOT1和Flag-POT1的HEK293T细胞中的表达水平。以空载体和pLKO.1慢病毒载体感染的细胞为对照。
(c，d，e)表达shPOT1和WT或突变的flPOT1的HEK293T细胞的Southern杂交。图中显示了来自5个、50个和120个群体加倍(PD)的DNA。DNA长度标准显示在凝胶的左右两边。白色虚线表示单独转染载体的HEK293T细胞的平均端粒长度，在5、50和120pD后不表达shPOT1。向量(-shPOT1)、向量(TOP ShPOT1)和WT POT1(TOX ShPOT1)控件分别用绿色和黄色圆点表示。POT1突变体(L343F、P466Q、P475L、R477T、A532P、I535F、C591W和Q623H)用红点表示。
(F)对小组(c、d和e)的平均端粒长度(Kb)进行量化。使用与面板C、D和E相同的配色方案。黑条表示端粒限制片段(TRF)的范围。
我们用Western印迹分析证实了在所有细胞系中，在shPOT1存在的情况下，外源WT和突变的POT1蛋白表达水平相似(图7B)。我们发现，单独的载体(没有shPOT1)的端粒DNA长度即使在70个群体倍增(PD)后也几乎保持不变。相反，单独的载体和经shPOT1处理的WT POT1细胞株在50和120PD后端粒显著延长。更具体地说，没有shPOT1的载体的平均端粒长度为4.5kb。120pD后，重组载体和野生型POT1和shPOT1细胞的端粒长度分别为B12.5和8.5kb。与没有shPOT1的载体相比，部分破坏POT1-TPP1复合体和shPOT1的POT1突变体转染的细胞株在50和120群体倍增后也有更长的端粒(图7C-f)。部分破坏POT1-TPP1复合体的POT1突变体P446Q、C591W和Q623H的端粒长度变化最显著。P446Q、C591W和Q623H的端粒长度分别增加了约4.5、10和12.5kb(图7C-f)，而L343F、P475L、R477T、A532P和I535F的端粒长度增加了3-5kb(图7C-f)。
为了更好地了解POT1癌症相关突变在端粒维持中的作用，我们用荧光原位杂交(FISH)方法检测了感染WT或突变体POT1(与Southern印迹分析相同，图7B)的HEK293T细胞的表型。这些细胞系中的内源性POT1因感染shPOT1而减少(图7A)。我们用甲醛将染色体固定在显微镜玻片上，并将端粒与50 Telc-Tamra多肽核酸(PNA)探针杂交，从而制备了这些细胞系的中期铺展。成像前用DAPI染色染色体DNA。我们统计了感染后50个群体的染色体融合、脆弱端粒和端粒自由端的频率。携带空载体的HEK293T细胞平均有2-3%的染色体出现染色体融合、脆性和端粒缺失，与高表达WT POT1的细胞系相似。L343F(7%)和I535F(5%)POT1突变体的融合水平分别升高(图8a，b)。有趣的是，与空载体和WT POT1的B3%相比，所有POT1突变体的脆性端粒(L343F9%；P446Q，R477T和Q623H，9%；P475L和C591W 10%)显著增加(图8A，c)。我们还观察到，在过度表达L343F、R477T(7%)和I535F(12%)POT1突变体的细胞中，端粒缺失水平升高(图8A，d)。
(b-d)，(a)中期铺展的端粒融合、脆性端粒和缺失端粒的量化。线条表示中期事件的百分比。错误条指示为S.D.。每个实验平均计算了500条染色体。
与POT1C自然发生的突变相关的癌症表型是多样的(家族性黑色素瘤、胶质瘤和CLL，补充表1)，这表明端粒复合体POT1-TPP1在端粒上的复杂性质和功能。N-末端，POT1疾病突变破坏POT1-DNA结合并释放端粒悬垂，从而导致端粒酶持续的端粒复制。目前没有证据支持POT1C或POT1C TPP1(PBD)，DNA结合(图5A)。然而，POT1C与TPP1相互作用，破坏复合物的POT1突变预计会影响其功能，包括端粒定位、刺激端粒酶加工和增强POT1 DNA结合活性。此外，POT1突变在很长一段时间内会赋予端粒不稳定的表型，这一事实可能提供克隆进化所需的遗传变异。这在具有高肿瘤负担的肿瘤中更加明显，例如CLL，其细胞总数将在10-100s的数十亿范围内。因此，这些肿瘤的长期发展和肿瘤负担的结合意味着，即使是端粒稳定性的微小缺陷也可能对长期临床结果产生戏剧性的影响。
我们关于几个参考的疾病相关POT1突变的数据支持上述假设。细胞成像显示，所有报道的POT1突变蛋白都定位于端粒(图6)。尽管所有POT1突变蛋白都定位于端粒突出处，但FP分析表明，只有部分破坏POT1-TPP1复合体的突变体(P446Q、C591W和Q623H)与端粒DNA的亲和力显著降低(图3和5c，d)。POT1-TPP1复合体对端粒悬垂的亲和力降低将导致端粒酶30持续的端粒延长。染色体末端持续的端粒酶作用将产生比WT POT1-TPP1复合体更长的端粒(图7C，d)。这一观察结果与Southern印迹分析一致，该分析表明，转导POT1C突变体的HEK293T细胞的端粒长度比转导WT POT1的细胞长。这一观察结果对于部分破坏POT1-TPP1复合体的POT1突变体尤其明显，P446Q、C591W和Q623H的端粒长度分别增加了4.5kb、10kb和12.5kb(图7)。此外，研究还证实，不受调节的端粒长度会导致与端粒信号自由端和脆性端粒相关的染色体异常。与这一假设一致，破坏POT1-TPP1复合体的POT1突变显示缺失和脆弱的端粒水平升高(图8)。当涉及到脆性端粒时，这种缺陷尤其明显，所有POT1突变体的脆性端粒平均为10%，而空载体和WT POT1的脆性端粒平均为B3%。有趣的是，没有一种疾病突变似乎影响端粒酶活性(图4c-f)。
我们证明了几个参考的POT1突变(P446Q、C591W和Q623H)部分破坏了POT1-TPP1复合体(图3C，d，g-i)。这一观察结果与POT1-TPP1结构(图2)以及Liu等人以前报道的数据相一致，后者表明POT1的417-445和616-628与TPP1直接接触。P446Q对TPP1结合至关重要，因为它包含连接HJR链b6和b7和TPP1的N-末端螺旋A1的坐标L271的环的一部分(图2B)。P475L突变体表现出POT1-TPP1复合体的边缘破坏，形成位于HJR结构域核心的b8的一部分，并有助于该结构域的折叠(图2B)。脯氨酸到亮氨酸的变化很可能微妙地扰乱了该残基周围HJR结构域结构元素的组织，包括螺旋a5的重组，这使其与TPP1的A1发生广泛的相互作用，从而影响POT1-TPP1结合(图2B)。C591W位于螺旋A8的C-末端，横跨OB-折叠的整个侧面，在POT1C的这个结构域的组织中起着关键作用(图2e)。此外，螺旋A8的N-末端部分与TPP1的螺旋A2，特别是W293的侧链发生了广泛的相互作用。POT1螺旋A8的移位会导致POT1C(OB)这一区域的重组，从而影响TPP1的结合。POT1-TPP1结构还表明Q623与TPP1直接啮合(图2e)。Q623残基位于POT1C OB-折叠的正则结合口袋的中心，可溶的侧链与TPP1的螺旋A3的骨架配位。更具体地说，Q623的NE2与TPP1的L313的羧基发生了有效的氢键。在这个位置引入更大的疏水侧链将导致氢键的丧失和螺旋从当前位置的重排。螺旋A3的结构重组会影响A3残基V308、L313和I315及其连接环与POT1C OB折叠的V543、Y558、M560、Y610和F625之间的广泛相互作用网络，从而影响POT1-TPP1结合。
与P446Q、C591W和Q623H不同，L343F、P475L、R477T和A532P POT1C突变体具有WT、TPP1和DNA结合亲和力(图3和图5)。L343F包括连接POT1C、OB-折叠、b-链b1和a-螺旋A1的环的一部分。L343对于这个环的结构组织很重要，不与TPP1(图2A)直接接触。同样，R477T是HJR的b8的一部分，位于该结构域的相对面，与TPP1的螺旋A1结合(图2D)。与L343不同的是，R477暴露在溶剂中，不与TPP1接触；事实上，最近的TPP1接触点是B18äaway。A532是POT1(HJR)的A7的一部分，与R477一样，位于TPP1的螺旋A1结合的HJR结构域的对侧。I535位于HJR结构域的A7，疏水侧链嵌入该结构域的核心。引入更大的苯丙氨酸侧链会破坏HJR结构域的核心，从而导致蛋白质的不稳定(图2D)。有趣的是，分离A532P，特别是I535F POT1C和flPOT1突变蛋白导致了比WT蛋白更低的蛋白质水平(补充图1B，c)。这一发现表明，A532和I535残基的A到P和I到F氨基酸的变化很可能影响这些突变的POT1蛋白的稳定性。分离的I535F蛋白不能产生足够数量的这种多肽用于TPP1和DNA结合分析。然而，在基于细胞的分析中，这些突变蛋白似乎处于WT水平，这使我们能够研究它们在端粒酶活性、加工性、端粒定位和端粒缺陷（包括端粒长度）和染色体异常中的作用（图4）。Southern杂交分析显示，图7d,e-大约3-5Kb的端粒长度发生了变化，例如，I535F突变体的端粒FISH染色中端粒融合、脆弱和缺失的端粒也显著增加(图8)。
综上所述，我们的数据表明，POT1C突变导致恶性影响的因素汇聚在一起。其中一些突变(P446Q、C591W和Q623H)部分破坏了POT1-TPP1复合体和POT1的DNA结合亲和力，这反过来又影响了复合体有效调节端粒酶进入端粒的能力。解除对染色体末端端粒酶活性的调控将导致结构性端粒延长和增殖潜力增加。在一定程度上，POT1通过调节端粒酶对端粒的访问来调节端粒长度，这种作用受TPP1结合的调节。因此，POT1-TPP1复合体的部分破坏可能导致端粒酶持续进入端粒突出部分，从而导致更长、更脆弱的端粒。
令人惊讶的是，如我们的结构和生化数据所示，一组已报道的疾病突变(L343F、A532P和R477T)似乎对POT1-TPP1复合体的组装没有显著影响(图2-7)。然而，值得注意的是，所有这些突变都显示出脆性端粒显著增加，端粒长度缺陷，端粒缺失和染色体融合。这些突变在POT1-TPP1功能中的确切作用目前尚不清楚，需要进一步研究才能更好地了解它们在癌症中的作用。
已在家族性黑色素瘤和神经胶质瘤中检测到POT1基因的胚系变异。已在POT1中发现体细胞突变，并已确定为CLL的易感基因。在CLL B细胞克隆中也发现了POT1的体细胞突变，虽然这些突变对端粒长度的影响尚未确定，但它们与染色体不稳定性的增加有关。值得注意的是，POT1突变在黑色素瘤、胶质瘤和CLL患者中的致癌作用通常与一系列其他缺陷基因结合在一起，如CDKN2A、CDK4、BAP1、Notch1、SF3B1、TP53和ATM，这些基因已被发现使患者容易患上这些恶性疾病。根据CLL B细胞克隆的端粒长度对CLL患者进行分层，发现那些端粒较短的患者，在可以检测到端粒融合的长度范围内，表现出极差的预后。这被认为是端粒驱动的基因组不稳定、克隆进化和肿瘤进展的结果。虽然大多数端粒较长的患者表现出更好的预后和更稳定的基因组，但仍有一部分患者的病情进展。因此，研究体细胞POT1突变、端粒长度和染色体不稳定性之间的关系以及这对疾病进展的影响将是有意义的。
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